【論文】肝細胞癌に対するフアイア菌糸体抽出物のマクロファージ極性化制御による抗腫瘍効果の検証

対象論文

項目	内容
和訳タイトル	新規の抗腫瘍薬効評価のために開発された、金魚における肝細胞癌の同所性異種移植モデル
英題	A novel goldfish orthotopic xenograft model of hepatocellular carcinoma developed to evaluate antitumor drug efficacy
発表年	2024年
筆頭著者	Fenghua Zhang
責任著者	Xianmei Li
発表学術誌	Fish & Shellfish Immunology（魚類および甲殻類の免疫学、病理学、比較免疫学分野におけるトップクラスの国際的査読付き学術誌）
DOI	https://doi.org/10.1016/j.fsi.2024.109998

研究の信頼性チェック（PICO）

項目	内容
P (Patient/Problem)	・宿主：7日齢（7 dpf）の野生型金魚（Carassius auratus）の胚/仔魚。・移植腫瘍：ヒト肝細胞癌（HCC）細胞株「MHCC-97L」（低転移性）および「MHCC-97H」（高転移性）。蛍光色素（CM-DiIまたはDiO）で標識し、1個体あたり約300細胞を移植。　・一部比較用宿主：2日齢（2 dpf）の遺伝子組換えゼブラフィッシュ胚（Tg(mpeg1.1:GAL4,UAS:mCherry)）。
I (Intervention)	・金魚胚の肝臓領域へのヒトHCC細胞の同所性移植（Orthotopic transplantation）。・飼育環境温度の変更（28℃から36℃への加温）。・抗腫瘍薬の投与：分子標的薬ソラフェニブ（Sorafenib: 0.2 μM）、ヨモギ顆粒（2 mg/mL）の単独および併用投与（3日間連続、毎日換水）。
C (Comparison)	・宿主の比較：7日齢ゼブラフィッシュ胚（体長、肝臓面積の比較）。・細胞株の比較：MHCC-97L（低転移性）vs MHCC-97H（高転移性）。・温度の比較：28℃飼育 vs 36℃飼育。・治療群の比較：対照群（DMSO投与）vs ソラフェニブ単独群 vs フアイア単独群 vs ソラフェニブ＋フアイア併用群。
O (Outcome)	・腫瘍細胞の増殖：移植後2時間（2 hpt）および72時間（72 hpt）における蛍光面積の測定、EdUアッセイによる細胞増殖率（%）。・腫瘍細胞の転移：2 hptおよび24 hptにおける尾部への移行細胞数、脳転移率（%）、頭部移行細胞数。・アポトーシス：TUNELアッセイによるアポトーシス細胞率（%）。・宿主生存率：移植後5日目（5 dpt）における金魚の生存率（%）。・免疫微小環境：ニュートラルレッド染色による肝臓マクロファージ浸潤数、RT-qPCRによるマクロファージ極性化マーカー（M1: tnfα, il1β / M2: il4, il10）のmRNA発現量。

試験デザインとサンプル数

項目	内容
研究デザイン	異種移植（Xenograft）モデル開発研究、およびin vivo（生体内）薬効・病態評価実験。
サンプルサイズ	各実験に用いた金魚幼生の個体数は明記されておらず、実験は独立して3回実施されたと記載されている。
研究期間	評価項目によって異なる。薬効評価では3日間連続で薬剤を投与し、移植後2、24、72時間など複数の時点で評価を実施した。
統計解析	Student's t検定を使用し、統計的有意水準はP < 0.05、P < 0.01、P < 0.001と表示。

結果の詳細

【金魚胚の解剖学的優位性と高い移植後生存率】

Zhangら（2024）の研究チームがFish & Shellfish Immunologyで発表した検証によると、7日齢の金魚胚はゼブラフィッシュ胚と比較して平均体長が約1.5倍、平均肝臓面積が約2.2倍の7.03×10⁴ μm²であり、統計的に有意な差（P < 0.001）が認められた。

この解剖学的サイズ差により、ゼブラフィッシュでは困難であった肝臓内への正確な同所性移植が可能となった。

ヒト肝細胞癌細胞を移植した後の金魚胚の生存率は、移植後5日目においてMHCC-97L移植群で89.4%、MHCC-97H移植群で90.7%と極めて高く、移植手技に伴う急性死亡のリスクが非常に低いことが実証された。

【腫瘍細胞株の特性に応じた増殖および転移能の可視化】

同検証によると、低転移性株であるMHCC-97Lと高転移性株であるMHCC-97Hを移植し、生体内における挙動が比較された。

移植後72時間における腫瘍面積は、MHCC-97L群の1.96×10⁵ μm²に対し、MHCC-97H群では2.30×10⁵ μm²と有意に高い増殖性（P < 0.05）を示した。

さらに、移植後24時間における尾部への転移細胞数は、MHCC-97H群がMHCC-97L群の1.7倍（P < 0.001）に達した。

脳への転移率についても、MHCC-97L群の約10.5%に対し、MHCC-97H群では約16.5%（P < 0.05）と有意に高い値が確認され、臨床的な悪性度がモデル上で再現された。

【飼育温度が腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスに及ぼす影響】

同検証によると、ヒト腫瘍細胞の生理活性を維持するための最適な飼育温度が検証された。

金魚の通常飼育温度である28℃環境と比較して、36℃環境で飼育された群では、EdU陽性細胞で評価した腫瘍増殖率が約24.8%から約43.6%へと有意に上昇（P < 0.01）した。

一方で、TUNELアッセイにより評価したアポトーシス細胞の割合は、28℃環境の約28.8%から36℃環境では約19.9%へと有意に減少（P < 0.05）した。

この結果から、ヒト肝細胞癌細胞の定着と増殖には36℃への加温が適していることが明らかとなった。

【薬剤毒性試験による安全濃度の決定】

同検証によると、治療実験に先立ち、金魚胚に対する薬剤の安全濃度が検討された。

ソラフェニブにおいては、0.4 μM投与時の死亡率が約7.8%、重度奇形が17.8%、軽度奇形が36.7%、正常様が37.7%であったのに対し、0.2 μMでは死亡率が0%、軽度奇形が6.7%、正常様が93.3%となり、これが安全濃度として採用された。

フアイアにおいては、4 mg/mL投与時の死亡率が約4.4%、軽度奇形が26.7%、正常様が68.9%であったのに対し、2 mg/mLでは死亡率が0%、軽度奇形が4.4%、正常様が95.6%となり、これが安全濃度として採用された。

【ソラフェニブとフアイアの併用による抗腫瘍効果の相乗的強化】

同検証によると、分子標的薬であるソラフェニブと、生理活性成分であるフアイアの単独および併用効果が検証された。

移植後72時間における腫瘍面積は、両薬物の単独投与群で有意に縮小し、併用群において最も強力な抑制効果（P < 0.001）が確認された。

また、移植後24時間における尾部転移細胞数において、ソラフェニブ単独群および併用群では有意な抑制効果（P < 0.001）が認められたが、フアイア単独群では明らかな転移抑制効果は示されなかった。

細胞増殖率（EdU陽性率）は、対照群の約42.0%に対し、ソラフェニブ単独群で約21.7%（P < 0.001）、フアイア単独群で約21.4%（P < 0.001）、併用群では約14.9%（P < 0.001）まで低下した。

アポトーシス率（TUNEL陽性率）は、対照群の約21.2%に対し、ソラフェニブ単独群で約39.0%（P < 0.01）へと有意に上昇し、フアイア単独群では約28.7%（有意差なし）であり、併用群では約45.1%（P < 0.001）へと最も上昇した。

【フアイアによるマクロファージ極性化の制御と免疫微小環境の改善】

同検証によると、腫瘍微小環境におけるマクロファージの動態が解析された。

ニュートラルレッド染色による評価において、ソラフェニブ単独群では肝臓へのマクロファージ浸潤数に変化は見られなかったが、フアイア単独群および併用群では浸潤数が有意に減少（P < 0.001）した。

遺伝子発現解析（RT-qPCR）において、ソラフェニブ単独群では抗腫瘍性M1マーカーであるtnfαの発現に変化はなく、il1βがわずかに上昇したのみであった。さらに、腫瘍促進性M2マーカーであるil4は低下したものの、il10は有意に上昇（P < 0.01）した。

これに対し、フアイア単独群および併用群においては、M1マーカーであるtnfαおよびil1βの発現が著しく上昇（P < 0.001）し、同時にM2マーカーであるil4およびil10の発現は著しく低下（P < 0.001）し、フアイアがマクロファージを抗腫瘍表現型へ極性化させることが示された。

獣医療への応用可能性と専門的考察

【臨床現場での活かし方】

同検証によると、フアイアによるマクロファージ極性化の制御作用は、犬猫の進行性または非切除性の肝細胞癌における新たな補助療法の選択肢として応用できる可能性を示唆している。

特に、標準治療である外科的切除が適応外となる症例や、高齢などの理由で積極的な抗がん剤治療を選択できない症例において、科学的根拠に基づいたセーフティネットとしての役割が期待される。

臨床現場においては、分子標的薬であるトセラニブなどの既存治療にフアイアを併用することで、直接的な腫瘍制御と免疫微小環境の改善を同時に狙う多標的アプローチが可能になると考えられる。

これにより、個々の症例のQOLを維持しながら、生存期間の延長を目指す治療設計が模索できる可能性がある。

【既存治療との比較】

同検証によると、従来の犬猫の肝細胞癌治療では外科的切除が第一選択であり、切除不能な場合は化学療法や分子標的薬が単独で用いられてきた。

しかし、単一薬剤による治療は耐性獲得や副作用の発生が大きな障壁となる。

本研究で実証されたソラフェニブとフアイアの併用療法は、直接的なチロシンキナーゼ阻害作用と、宿主の自然免疫系を介した抗腫瘍効果を組み合わせたものである。

このアプローチは、既存の単一標的治療と比較して、副作用を最小限に抑えつつ、腫瘍の増殖および転移を多角的に抑制できる点で優れていると考えられる。

【研究の限界（Limitation）と批判的吟味】

同検証によると、本研究の限界として、金魚胚モデルにおいては適応免疫系が未成熟であり、主に自然免疫系のみの評価に留まっている点が挙げられる。

また、マクロファージを特異的に蛍光標識したトランスジェニック金魚系統が存在しないため、生体内でのリアルタイムな相互作用の動的観察は行われていない。

さらに、変温動物である金魚を36℃の熱ストレス環境下で飼育している点や、犬猫との解剖学的・生理学的な種差を考慮する必要がある。

したがって、本研究の成果をそのまま犬猫の臨床効果として断定することはできず、今後の恒温動物モデルや臨床試験における検証を冷静に見極める必要がある。

読者のためのミニ用語集

フアイア抽出物（Huaier）：Trametes robiniophila Murrと呼ばれる薬用茸から抽出された生理活性成分であり、抗腫瘍効果や免疫調節作用を持つことが知られている。
同所性移植（Orthotopic transplantation）：腫瘍細胞をその発生起源となる組織または臓器（本研究では肝臓）に直接移植する手法であり、異所性移植と比較して実際の腫瘍微小環境をより正確に再現できる。
マクロファージ極性化：微小環境のシグナルに応じてマクロファージが抗腫瘍性のM1型、または腫瘍促進性のM2型へと表現型を変化させる現象を指す。
ソラフェニブ：RafキナーゼやVEGFRなどを標的にするマルチキナーゼ阻害薬であり、ヒトの進行性肝細胞癌における標準的な分子標的薬として使用されている。

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